改性生物炭对汞污染土壤绿豆生长及汞含量的影响
符 倩，李 路，张皓月，孙芳强，王晓娟，赵倩，毛 晖
(1. 西北农林科技大学 资源环境学院，陕西杨凌 712100；
2.山东省第五地质矿产勘查院，山东泰安 271000；
3.中国地质调查局干旱-半干旱区地下水与生态重点实验室，西安 710054；
4. 中国地质调查局西安地质调查中心，西安 710054)
汞是一种剧毒重金属，对人体中枢神经系统及作物生理活性有着很强的毒性作用，被世界卫生组织(WHO)列为“重大公共卫生关注的十大化学品或化学品类之一”[1]。环境中汞的来源主要分为自然源和人为源两种。自然源主要包括地质活动、森林火灾和自然风化等，人为源主要包括采矿冶炼、燃料燃烧和化肥农药等[2-3]。联合国环境规划署(UNEP)对全球汞污染调查发现进入大气中的汞约为5500～8900t·a-1，其中自然源仅占10%左右，人为源是汞污染的主要来源[4]。
旬阳县位于陕西省安康市，是中国汞的主要产地之一。旬阳县汞矿资源丰富，开采历史悠久，长期的汞矿开采活动严重的破坏了当地的生态环境，污染了当地的农田土壤[5]。据陕西省环境科学研究设计院调查结果显示，旬阳县汞矿区土壤总汞浓度范围为0.1～150mg·kg-1，参考GB15618-1995《土壤环境质量标准》中的三级标准(1.5mg·kg-1)对其进行评价，土壤汞污染超标率76.25%；
土壤污染区内的农作物总汞浓度范围为0.002～0.720mg·kg-1，参考GB2762-2005《食品中污染物限量》成品粮汞限量标准 (0.02mg·kg-1)对其进行评价，41.8%的农作物样品汞含量超标[6]。Qiu等[7]研究表明，旬阳县汞矿区周边的水稻总汞含量为0.05～0.2mg·kg-1，甲基汞含量为0.0082～0.08mg·kg-1，远超食品中汞限量标准。农作物从环境中摄取的汞可通过食物链的生物富集作用在人体内蓄积造成汞中毒，汞污染对当地居民的生命安全造成极大威胁，因此修复旬阳县汞污染土壤、提高作物的生物安全性迫在眉睫。
重金属污染土壤的修复技术主要包括热脱附、化学淋洗、电动修复、生物修复及固定稳定化技术等[8-9]。固化稳定化技术是通过物理和化学作用来共同固定土壤中污染物的修复技术。与其他技术相比，该技术具有修复效率高、修复成本低、适用范围广、无二次污染等优势。作为一种固定稳定化修复材料，生物炭原料廉价易得、制备工艺简单易行、生物炭材料环境友好且对土壤有一定的改良作用，是一种应用前景很好的重金属污染土壤修复材料。生物炭是由生物质原料在缺氧或绝氧环境中，通过高温热解制得的多孔疏松、官能团丰富、吸附性能优异的含碳固态产物[10]。近年来，一系列研究发现，生物炭由于其较高的孔隙结构、较多的表面官能团以及较大的比表面积，对于重金属污染土壤具有良好的修复作用[11-14]。然而由于生物炭在吸附能力和环境应用等方面具有一定的局限性，通常需要对其进行改性处理以进一步提高生物炭的表面活性和吸附性能[15]。
Liu等[16]通过KOH浸渍生物炭制得碱改生物炭，发现改性后的生物炭具有更大的比表面积、更丰富的孔隙度和更多的含氧官能团，对土壤Zn的吸附能力显著增强。范家俊[17]利用疏基乙醇催化酯化法制备了疏基改性水稻秸秆生物炭，改性后的生物炭对于土壤Cd的吸附量提高了约3倍，且土壤Cd被改性生物炭吸附之后不容易解吸下来。在重金属污染地区施用改性生物炭，一方面能够钝化土壤重金属降低土壤重金属的生物有效性，有效的修复重金属污染土壤；
另一方面能够实现农业废弃物资源的再利用。可以看出，改性生物炭在钝化修复重金属污染土壤和改善土壤环境质量方面具有一定的研究前景和可行性。但是，目前应用改性生物炭修复重金属污染主要集中在对砷(As)、镉(Cd)、铅(pb)、铬(Cr)、铜(Cu)、锌(Zn)污染土壤的修复，对于改性生物炭修复Hg污染土壤的报道较少，改性生物炭的应用还有待进一步的研究[18-20]。绿豆具有良好的食用价值与药用价值，是旬阳县主要种植作物之一，省内种植面积近40hm2。同时，绿豆对于土壤汞污染较敏感，可以作为土壤汞污染的指示植物。
综上所述，本试验选用改性生物炭作为研究对象，选用绿豆作为模式作物来研究改性生物炭对于绿豆生长和果实汞含量的影响，以期通过本研究对修复旬阳县汞污染土壤和提高作物的生物安全性提供理论依据和技术参考，本研究对于改善当地生态环境与保障人民生命安全具有重要的现实意义。
1.1 试验材料
本试验供试土壤取自陕西省旬阳县某镇汞矿区的农田表层(0～20 cm)土壤，农田采取的土壤经除杂自然风干后研磨过100目筛。供试土壤中总汞含量为52.3 mg·kg-1，甲基汞含量为4.9 μg·kg-1，土壤pH为6.2，有机质含量为 25.67 g·kg-1，Hg主要存在形态为HgS。供试生物炭为CaO改性生物炭，制备过程为将水稻谷壳去除杂质使用超纯水清洗干净，烘箱60 ℃烘干后粉碎，然后在马弗炉中550 ℃高温炭化4 h得到初始稻壳生物炭。随后将初始稻壳生物炭与改性剂CaO以10∶1的质量比混合均匀，在缺氧条件下300 ℃加热2 h，冷却至室温后取出过35目筛去除多余CaO，即得到CaO改性生物炭。为了解改性生物炭结构，对制备的改性生物炭进行了扫描电镜(SEM)观察，扫描图如图1所示。改性生物炭为中空结构，外表粗糙有凹凸颗粒，内部表面光滑平整。生物炭基本性质见表1。供试绿豆品种为绿宝绿豆，购于山西省太谷县绿宝种业有限 公司。
图1 改性生物炭扫描电镜内(左)外(右)结构图Fig.1 Internal (left) and external (right) structures of modified biochar under scanning electron microscopy
表1 改性生物炭基本性质Table 1 Basic properties of modified biochar
1.2 试验设计
本试验在西北农林科技大学资源环境学院旱棚以土培盆栽方式进行，以绿豆为供试作物。试验选取底部镂空的23 cm×13 cm的塑料花盆，每盆装干土1.50 kg。试验共设置4个处理：(1)不施加改性生物炭(记为CK)；
(2)施加0.67%土质量的改性生物炭(每盆10 g，记为C-10)；
(3)施加 2.00%土质量的改性生物炭(每盆30 g，记为C-30)；
(4)施加3.33%土质量的改性生物炭(每盆50 g，记为C-50)，每个处理设置4个重复。基肥为尿素 (0.30 g·kg-1)和磷酸二氢钾(0.20 g·kg-1)。将生物炭、基肥与土壤混合均匀后装盆，然后用蒸馏水浇灌使得土壤含水率达到田间最大持水量的70%，待土壤平衡1周后播种。每盆播种15粒种子，播种15 d后间苗，每盆留5株长势良好的幼苗。
1.3 样品采集及测定方法
待植株成熟后整株收获，先用自来水洗干净根系泥土再用超纯水将整株冲洗干净，然后用滤纸吸干表面水分。根据组织器官将植株分为根、茎、叶和果实，用电子天平称量各器官鲜生物量。为了避免根部表面附着的汞对最终测定结果产生影响，将根部用0.01 mol·L-1HNO3超声清洗 30 s，然后用超纯水冲洗3次并擦干表面水分。将植物各部分的组织器官分别装入纸袋，在烘箱中105 ℃杀青30 min后使用65 ℃烘干至样品恒质量。用电子天平称量各器官干生物量，然后将干燥样品在碳化钨球磨仪(莱驰MM 400，德国)中粉碎后装到密封袋保存备用。将绿豆粉碎样用浓HNO3-H2O2微波消解(屹尧WX-8000，中国)处理，利用液相-原子荧光光度计(海光LC-AFS-8530，中国)测定各器官中的汞含量，利用石墨炉原子吸收分光光度计(日立Z-2000，日本)测定各器官中微量元素含量，利用近红外品质分析仪测定果实品质指标(波通 DA 7250，瑞典)，利用南京建成试剂盒对绿豆叶片过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性进行测定。
1.4 数据处理
采用SPSS 26.0对试验数据进行统计分析，采用LSD法进行多重比较，显著性差异为P< 0.05。
2.1 施用改性生物炭对汞污染地区绿豆各器官生物量的影响
由图2绿豆种植15 d后的生长状况可知：与CK相比，C-10处理生长状况无明显变化；
C-30与C-50处理较为显著的促进了绿豆幼苗的生长，C-30与C-50处理间无显著差异。由表2绿豆各器官生物量的变化可知：施加改性生物炭后，绿豆各器官的鲜重干重生物量相较于CK均有不同程度的增加，各器官含水率无显著性差异。总体来看生物量提升效果以C-30处理最好，其根、茎、叶、果实的干生物量增幅分别达到7.04%、 40.86%、33.33%和52.76%。
图2 绿豆种植15 d后生长状况Fig.2 Growth of mung bean after 15 days of sowing
表2 施用不同比例的改性生物炭对绿豆各器官生物量的影响Table 2 Effects of different proportions of modified biochar on biomass of mung bean organs
2.2 施用改性生物炭对汞污染地区绿豆各器官汞含量的影响
生物炭具有很强的吸附性能，可以通过吸附固定土壤中的汞降低植株对于汞元素的吸收。由图3绿豆各器官汞含量变化可知：施加不同比例的改性生物炭后，绿豆各器官中的汞含量相较于CK均显著降低，且汞含量随着改性生物炭施加量的增加而降低，其中以C-50处理效果最佳，根、茎、叶、果实中的汞含量降幅分别达到74.34%、86.02%、70.66%和84.93%。
图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),下同
施加改性生物炭后，茎叶中的汞含量显著降低。相较于CK，C-10、C-30和C-50处理的茎汞含量分别降低了64.82%、85.41%和86.02%；
叶汞含量分别降低了63.41%、65.77%和70.66%。在CK处理中，果实中的总汞含量高达0.073 mg·kg-1，远超过GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定的谷物及其制品中的总汞限量标准0.02 mg·kg-1。施加生物炭后，C-10、C-30、C-50处理中的果实汞含量分别达到0.025 mg·kg-1、0.012 mg·kg-1和0.011 mg·kg-1，相较于CK分别降低65.75%、 83.56%和84.93%。其中C-30和C-50处理中的汞含量显著低于国标食品中总汞限量标准，达到可食用标准。
2.3 施用改性生物炭对汞污染地区绿豆各器官微量元素含量的影响
由表3绿豆各器官中微量元素含量的变化可知：在C-10与C-30处理中，相较于CK，施加改性生物炭后根中的微量元素含量总体上呈下降趋势，而茎、叶、果实中的微量元素含量总体上呈上升趋势。在C-50处理中，相较于CK，施加改性生物炭后绿豆各器官中微量元素的含量整体上呈下降趋势。绿豆各器官微量元素含量受施加剂量的影响。
表3 施用不同比例的改性生物炭对绿豆各器官微量元素含量的影响Table 3 Effects of different proportions of modified biochar on trace element contents in mung bean organs mg·kg-1
2.4 施用改性生物炭对汞污染地区绿豆果实品质的影响
由表4果实氨基酸含量变化可知，相较于CK，施加生物炭抑制了C-10处理的氨基酸含量，促进了C-30与C-50处理的氨基酸含量，C-30与C-50处理无显著性差异。由表5果实品质指标含量变化可知，施加生物炭后灰分、碳水化合物、蛋白质、脂肪与氨基酸含量变化趋势一致，C-10处理均降低了其含量，C-30与C-50处理均增加了其含量。结合表3果实的微量元素含量来看，果实品质以C-30处理最佳。相较于CK，C-30处理的第一限制性氨基酸蛋氨酸含量提高了 13.16%，人体必须的八大氨基酸总含量提高了 10.93%；
灰分、碳水化合物、蛋白质和脂肪含量分别提高了2.83%、1.78%、10.21%和14.97%。
表4 施用不同比例的改性生物炭对绿豆果实氨基酸含量的影响Table 4 Effects of different proportions of modified biochar on amino acid content in mung bean fruit %
表5 施用不同比例的改性生物炭对绿豆果实品质的影响Table 5 Effects of different proportions of modified biochar on mung bean quality %
2.5 施用改性生物炭对汞污染地区绿豆叶片酶活性的影响
由图4绿豆叶片酶活性的变化曲线可以看出：施加改性生物炭后，绿豆叶片中的POD与CAT活性均呈现出低促高抑的趋势。在C-10和C-30处理中，酶活性随着改性生物炭施加量的增加而增加，POD和CAT活性均在C-30处理中达到最大值，其增幅分别为215.03%和 86.31%。随着改性生物炭施加量的增加，POD与CAT活性在C-50处理中达到最小值，其降幅分别为 2.70%和28.02%。
图4 施用不同比例的改性生物炭对绿豆叶片酶活性的影响Fig.4 Effects of different proportions of modified biochar on enzyme activities of mung bean leaves
3.1 施用改性生物炭对绿豆各器官生物量的影响
施加改性生物炭后绿豆各器官生物量有所提升的原因可能是：首先，改性生物炭本身含有丰富的矿质元素，施加改性生物炭能够为土壤补充N、P、K等营养元素，改善土壤理化性质，提升土壤肥力，进而促进植物对于营养元素的吸收转运[21-22]。其次，改性生物炭具有较高的孔隙结构、较多的表面官能团以及较大的比表面积，因此改性生物炭在使用过程中能够表现出较强的吸附能力，可以有效的固化土壤中的营养元素，防止土壤养分的流失[23]。此外，本试验采用碱性氧化物CaO对生物炭进行改性，改性生物炭中富含碱性物质CaO且含有很多的K、Ca、Na、Mg等盐基离子，施用改性生物炭能够提高土壤pH，增加土壤胶体表面的负电荷，强化土壤对于汞的吸附作用，降低土壤汞的生物利用度，缓解汞元素对于植物生长的胁迫作用，促进植株的生长发育从而提高植株生物量[24]。然而，当改性生物炭施加量过多时也会抑制植物的生长。在本试验中，当改性生物炭施加量达到50 g时，绿豆植株生物量相较于施加30 g改性生物炭时稍有下降，这可能是因为施加过多的改性生物炭提高了土壤的pH，改性生物炭在钝化汞的同时也钝化了土壤中的营养元素，降低了营养元素的生物可利用性，阻碍了植物对于营养元素的吸收，延缓了作物的生长从而使得植株的生物量有所降低[25]。
3.2 施用改性生物炭对绿豆各器官汞含量的影响
对于绿豆的根来说，其与土壤中的汞污染物直接接触，受土壤汞污染物的影响较大。在本试验中，根中的汞含量显著高于茎叶和果实中的总汞含量，说明根是植株中汞元素的主要富集部位，这与前人的研究结果一致[26]。施加改性生物炭后根中的汞含量显著降低，这可能是因为改性生物炭较大的比表面积和较高的孔隙结构使其具有较强的吸附能力，可以将汞吸附固化起来，降低土壤中的汞含量；
另外，改性生物炭表面的活性官能团可以作为配体与土壤中的汞发生络合反应，形成金属络合物从而降低汞的迁移性，抑制植物对于汞的吸收[27]。一般来说，植物主要通过根系吸收污染物，然后将污染物转运到植株的地上部器官，因此污染物在植物体内的含量一般遵循根>茎>叶。然而在C-30与C-50处理中，叶片中的汞含量几乎是茎中汞含量的两倍。这可能是因为土壤中的汞含量相对较高，在植物生长过程中土壤中有一部分汞经高温挥发进入大气中，然后挥发的气态汞通过植物叶片的气孔重新进入植物体内，致使叶片中的汞含量高于茎中的汞含量[28]。
土壤汞污染不仅会抑制植株的生长，还会通过食物链进行生物蓄积和生物放大，对人体健康造成严重威胁，因此食品安全问题很值得关注。C-30和C-50处理中的汞含量显著低于国标食品中总汞限量标准，达到可食用标准。这一结果表明改性生物炭在治理修复汞污染农田土壤中具有较好的钝化效果，施加改性生物炭降低了汞的生物有效性与迁移性并抑制了其向地上部的转运与分配，缓解了汞污染农田对于植物生长的危害性，提高了可食用部分的生物安全性[29]。综合来看，C-30与C-50处理的汞钝化效果无显著性差异。同时考虑经济成本与钝化效果，生物炭施加量以C-30处理为宜。
3.3 施用改性生物炭对绿豆各器官微量元素含量的影响
微量元素在植物的各种生理代谢过程中起着关键的调控作用，是植物生长过程中必不可少的营养成分[30]。施加生物炭后，地下部与地上部微量元素含量呈现不同趋势的原因可能是根部作为与改性生物炭直接接触的植物器官受改性生物炭钝化效果较强，施加改性生物炭明显的抑制了其对于微量元素的吸收，而茎、叶、果实属于植物的地上部器官受改性生物炭钝化的效果较弱，并且改性生物炭孔隙结构丰富，施加改性生物炭可能会降低土壤容重、提高土壤孔隙度、改善土壤的水肥气热状况，从而促进微量元素向地上部器官转运[31]。此外，根从土壤中吸收微量元素后，依次将微量元素转运到茎、叶、果实中。由于不同微量元素在植物体内的吸收转运能力以及植物不同器官对于微量元素的需求不同，各元素在不同器官中的含量有所差异。
相较于CK，C-50处理各器官的微量元素整体上呈下降趋势，说明在汞污染土壤上施加高剂量的改性生物炭会抑制绿豆植株对于微量元素的吸收。出现这一现象的原因可能是CK土壤pH偏酸性，土壤中有效态微量元素含量较高，有利于植株吸收微量元素。改性生物炭中含有较高的灰分以及K、Ca、Na、Mg等盐基离子，施加改性生物炭后土壤pH有所提高，抑制了土壤中微量元素的生物有效性，从而降低了植株对于微量元素的吸收。杨丽娟等[32]通过田间长期定位试验研究发现土壤pH是影响土壤微量元素含量的首要因素，土壤有效态Fe、Mn、Cu含量与土壤pH呈极显著负相关。谢忠雷等[33]通过调查研究中国13个茶园茶叶Mn含量发现，土壤pH显著影响茶叶Mn含量，茶叶中的Mn含量随pH的降低而增加。可见，土壤pH是影响植物对微量元素吸收利用的重要因素。过多的施加生物炭会提高土壤碱度，抑制微量元素的生物有效性从而降低作物对于土壤中微量元素的吸收。因此，在应用改性生物炭作为汞污染土壤钝化剂时要合理施用改性生物炭。
3.4 施用改性生物炭对绿豆果实品质的影响
绿豆不但营养丰富，而且含有多种人体必须的营养元素。随着人们生活水平的提高，对于食品品质的关注越来越多，因此有必要研究食品品质。施加生物炭后，果实品质出现先降低后升高的原因可能是因为土壤汞污染程度较严重，施加少量的生物炭不足以钝化土壤中的汞元素反而提高了土壤碱度，钝化了营养元素的生物有效性，抑制了营养元素在植物体内的吸收转运，致使C-10处理的各品质指标呈现出不同程度的降低；
生物炭施加量增加后，外源生物炭固化了土壤汞，缓解了汞污染对于植株的生长胁迫进而促进植株的生长发育与营养转运，改善果实品质。总体来看，C-30处理能够较为显著地缓解汞污染土壤对于绿豆植株的生长抑制，促进绿豆植株的生长发育，提高果实中的营养含量，改善果实的品质。
3.5 施用改性生物炭对绿豆叶片酶活性的影响
一般情况下，植物体内活性氧(ROS)的产生与消除处于动态平衡之中。但是当植物受到环境胁迫时，植物体内ROS的含量就会增加，一旦ROS的积累量超过抗氧化防御系统的清除能力，就会产生氧化胁迫损伤细胞。过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是广泛存在于生物体内的抗氧化防御酶，其功能是催化细胞新陈代谢过程中产生的H2O2的分解，缓解过量ROS积累对植物组织产生的直接或间接伤害，如氧化应激、DNA和蛋白损伤、膜脂过氧化、细胞功能丧失、细胞死亡等[34-35]。当植物机体受到重金属胁迫时，体内的ROS含量会大幅增加，细胞内ROS的产生和清除之间的平衡会遭到破坏，可能会导致植物代谢紊乱，影响植物正常的生长代谢功能。对于豆科作物而言，少量的自由基会激发植物的生理活性促进植物的生长，而当自由基的积累量超过了抗氧化防御系统的清除能力时就会抑制植物的生长[36]。抗氧化酶活性的增加能够提高植物机体抗氧化的能力，从而提高植物应对环境胁迫的能力。本试验中所用的生物炭采用CaO改性，其成品中大量的Ca2+可以促进植物体内氨基酸和多胺等物质的生成，氨基酸和多胺等物质可以直接清除植物体内的ROS也可以通过调节植物体内抗逆酶的活性来清除ROS缓解重金属引起的氧化损伤，在重金属污染土壤上施加此生物炭能够有效的缓解重金属胁迫对于植物生长的影响[37]。POD与CAT酶活性随着改性生物炭施加量的增加而降低，可能是因为绿豆植株体内ROS的产生速率大于清除速率，机体内产生的ROS无法及时被清除导致ROS在植株体内大量积累，对植株的细胞膜、细胞器造成氧化损伤，进而使植株体内抗氧化防御保护酶活性大幅降低[38-39]。
(1)改性生物炭中含有丰富的矿质元素，施加改性生物炭能够提升土壤肥力，促进植株的生长发育，增加绿豆各器官的生物量。
(2)改性生物炭能够缓解汞污染对绿豆植株的胁迫，提高植株应对汞胁迫的能力。同时，改性生物炭能够有效钝化土壤中的汞，降低植株对于汞的吸收，提高绿豆可食用部分的生物安全性。
(3)改性生物炭能在一定程度上改善果实品质，但是施加过量的改性生物炭会抑制营养元素吸收延缓作物生长，因此在实际应用中应根据其剂量-效应关系合理施用改性生物炭，在本试验中改性生物炭施加量以C-30处理效果最佳。
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