利用流式细胞术鉴定68,份三角梅基因组大小与染色体倍性
陈宜木，周 群，钟颖颖，张万旗，李可威，林悦其
(厦门市园林植物园，福建 厦门 361000)
三角梅是紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainvillea)中具有园艺价值的一类藤状灌木[1]，也叫叶子花、三角花、南美紫茉莉、九重葛、宝巾花、簕杜鹃、贺春红等，至今已有250 多年的栽培历史[2]。我国自1872 年在台湾省引种栽培[3]，随后渐扩至大陆各省。20 世纪80 年代，福建、广东、云南和海南等地开始大量引进三角梅优良品种，并逐步在我国南方大面积推广种植。三角梅因苞叶色彩丰富、花开繁茂，适应性强、耐修剪、易管理，应用范围广泛等特点而备受人们喜爱，现已被国内外30 多个城市选为市花[4]。但是长期以来我国三角梅繁殖多采用扦插、嫁接等方式无性繁殖，最终导致品种单一、品性退化、基因池变窄，不利于三角梅种质资源库的扩大及品种创新[5]。因此，选育出更多的三角梅新品种刻不容缓。
三角梅花被管细长，自然结实率低，且不同种质间结实性存在较大差异[6]，这与不同品种的花粉活力、花粉形态、柱头可授性有一定关系[6—10]。国外最初采用自然芽变育种[11]，后来采用辐射诱变和秋水仙素多倍体育种[12—17]，育种效率大幅提升。在国内，陈庭等[18]、孙利娜等[19]、邓红等[20]先后开展了三角梅辐射诱变育种，获得了不同类型的变异植株，也有通过化学诱变选育新品种的研究，获得一些表型变异的植株[21—22]。随着三角梅育性研究和新品种选育工作的深入开展，对三角梅染色体的倍性进行准确鉴定是非常必要的。孙鲁平[23]采用流式细胞分析法对197 份三角梅种质染色体倍性进行鉴定，发现‘Formosa’‘Mrs. Eva White"等179 份种质为二倍体，‘斑叶画报’等17 份种质为三倍体，‘Chitra’为四倍体，此外还发现‘Miss Manila’的大花变异材料为2n=2X=34 和2n=4X=68 的混倍体。然而，我国引进和自主选育的三角梅种质资源已达上千个，绝大多数三角梅种质资源染色体的倍性尚未明确，这使三角梅育性研究、倍性育种和杂交育种等工作受到限制，同时也影响到三角梅育种方法的选择。厦门市园林植物园建有国家三角梅种质资源库，收集保存三角梅活体种质资源600 余份，品种320 多个。为开展三角梅倍性育种和杂交育种工作，有必要对三角梅种质资源染色体倍性进行鉴定。
染色体倍性鉴定的方法有多种，如染色体观察法、形态观察法。染色体观察法虽然准确性高，但操作复杂、技术难度大、工作量较大[24—25]，而形态观察法的准确性比染色体观察法低得多[26]。近年来，流式细胞术成为植物染色体倍性鉴定、基因组大小测定等的重要工具[27]。流式细胞术可对处于液流中各种荧光标记的微粒进行多参数快速准确地定性和定量分析[28]。由于该方法具有快速、灵敏且可同时进行染色体倍性鉴定和基因组大小估测等优点而被广泛应用[29—30]，已成功用于茉莉花(Jasminum sambac)[31]、 杏(Prunus armeniaca)[32]、 兰 属(Cymbidium)[33]、香蕉(Musa nana)[34]、文心兰(Oncidium hybridum)[35]、桑树(Morus alba)[36]等多种植物染色体的倍性鉴定。本研究采用流式细胞术鉴定54 份国内外引进的三角梅种质资源及14 份实生种质的基因组大小和染色体倍性，为开展三角梅种质创新、倍性育种等研究提供参考。
1.1 材料
供试材料含54 份从国内外收集的三角梅种质资源和14 份实生种子苗，均种植于厦门市园林植物园国家三角梅种质资源库三角梅资源圃，管理措施和栽培环境基本一致。对照品种为二倍体‘福尔摩莎’。内参为番茄(Solanum lycopersicum)，内参基因组大小约900 Mbp，以番茄种子萌发后1 个月的幼苗嫩叶为实验材料，番茄种子由中国科学院昆明植物研究所提供。流式细胞仪(型号BD FACScalibur)由美国Becton Dickinson 公司生产。
1.2 方法
1.2.1 细胞悬浮液制备
采集各种质嫩叶，参考田新民等[28]的方法配制MGb解离液，参考李春牛等[31]的方法制备细胞悬浮液。
1.2.2 流式细胞仪检测
参考李春牛等[31]的方法，利用流式细胞仪对染色后的细胞核悬浮液样品进行上机检测。
1.2.3 计算基因组大小和染色体倍性
参考田新民等[28]、李春牛等[31]的方法，计算待测样品基因组大小和染色体倍性。
1.3 数据处理
采用Modifit3.0 软件对数据进行分析并制图。
2.1 流式细胞法倍性鉴定可行性
采用内参法对待测样品与内参样品同时进行检测，由此测定三角梅DNA 含量。结果显示内参与二倍体‘美露’、三倍体‘狂欢节’、四倍体‘蒙杜林’待测样品的峰值能完全分开，并且没有重叠峰，峰型也较清晰集中(图1)。由此表明，选用番茄为内参测定三角梅DNA 含量是可行的。
图1 三种倍性三角梅的FCM 测定分析Fig. 1 Histogram of cell peak values of three kinds of ploidy bougainvillea
2.2 三角梅种质资源的染色体倍性分析
对从国内外收集的54 份三角梅资源的DNA含量进行测定，根据内参和待测样品的荧光强度(表1)，计算出待测样品的基因组为2.48～5.12 Gb，其中，对照品种二倍体‘福尔摩莎’的基因组为2.66 Gb。根据待检测资源的基因组大小与对照品种的基因组大小的关系，计算待检测三角梅的染色体倍性。结果表明，所收集到的54 份三角梅资源中有29 份为二倍体，基因组为2.48～2.86 Gb；
有20 份为三倍体，基因组为3.65～4.22 Gb；
‘大杂斑叶画报’‘银叶画报’‘蒙杜林’‘欧洲奇特拉’等4份三角梅种质资源为四倍体，基因组为4.98～5.12 Gb (表1)。另外，‘大金边杨梅’为2X、4X、6X混倍体。
表1 收集的三角梅种质资源的基因组大小及倍性Table 1 Genome size and ploidy of collected germplasm of Bougainvillea
续表
2.3 实生种质的倍性分析
通过对14 份三角梅实生种质的DNA 含量进行检测(表2)，得到其基因组为2.60～5.02 Gb。以二倍体‘福尔摩莎’为对照，染色体倍性鉴定显示，三角梅实生种质二倍体5 份、三倍体8 份、四倍体1份。其中，编号为S-6、S-1、S-4、S-9、S-2 等5 份实生种质为二倍体，基因组为2.60～2.74 Gb；
编号为S-8、S-13、S-14、S-15、S-17、S-16、S-11、S-10等8 份实生种质为三倍体，基因组为3.85～4.05 Gb；
编号为S-3 的实生种质为四倍体，基因组为5.02 Gb。
表2 实生种质的基因组大小及倍性Table 2 Genome size and ploidy of seedings
流式细胞术测定细胞核DNA 含量有两种方法，分别为内参法和外参法。内参法的优点是可以避免样品差异、机器不稳定等因素造成的误差，但选用内参法测定细胞核DNA 要求所选用的内参细胞核DNA 含量是已知的且能保持稳定，并与待测样本DNA 含量相近[28]，内参样本的峰值不能与待测样本峰值重叠，最好与待测样本的G2 或M 期峰值不重叠[37]。目前较常用的植物内参有鸡红细胞核[33,38]、玉米B73[39]、番茄[40]、豌豆[28]等。通过检索植物基因组网站(https://cvalues.science.kew.org/search) C值，获知三角梅基因组为3.5～4.4 Gb。因此，选用番茄作为内参能与待测样品分开，待测样品与内参样品的G2 和M 期峰值不重叠，选用番茄为内参测定三角梅DNA 含量是可行的。
检测植物基因组大小是开展基因组学研究和进化生物学研究的基础[41]。我国在三角梅分子生物学方面的研究起步比较晚，相关报道集中于遗传多样性分析和分子标记开发等方面。随着国内外基因组学研究的不断发展，基因组大小或将成为基因组和转录组学研究的本底资料。本研究通过试验检测估算出三角梅基因组大小为 2.48～5.12 Gb，可为后续三角梅进化生物学和基因组学研究提供参考。
确定三角梅染色体倍性是进一步研究其生殖发育特点以及杂交育种或倍性育种的基础。对68 份三角梅资源的染色体倍性鉴定表明，34 份是二倍体、28 份是三倍体、5 份是四倍体、1 份是2X、4X、6X混倍体，三倍体和四倍体既有来源于收集的种质资源，也有实生种质，说明基于染色体倍性水平的三角梅种质资源具有丰富的遗传多样性，可为培育新品种提供丰富的亲本资源。
植物以多倍体存在是其进化的形式之一，多倍体植物一般在外观形态和生理生化指标等方面发生较大变化[42]，营养器官和生殖器官通常比二倍体个体大。孙鲁平[23]对‘Miss Manila’二倍体和‘Miss Manila (2×/4×)’三角梅植株的形态学和细胞学鉴定比较，发现后者叶片、苞片、花序柄长、芽刺长、花筒长、口径粗、染色体数目和花粉体积均显著增加。本研究鉴定的28 份三倍体和5 份四倍体共33份多倍体三角梅的叶、花等器官也较二倍体的大，这为选择三角梅育种策略提供参考。
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