miR-338-5p过表达对胃癌细胞进展及耐药基因表达的影响
邢智伟，常丽娟，史雅瑄，高雅楠，刘彩霞(内蒙古医科大学附属医院肿瘤内科，呼和浩特 00050；
内蒙古医科大学内科教研室；
通讯作者，E-mail:lcxzhg974@63.com)
胃癌发病率在恶性肿瘤里位居第5位，死亡率位居第3位，对人类健康构成了严重威胁[1]。胃癌早期的症状并不典型，仅表现出轻微的上腹部不适。当症状变得更加明显时，通常已经发展到病变晚期，并伴随癌细胞的远处转移。胃癌的高死亡率和不良预后与其侵袭性强、转移率高、增殖快、复发率高密切相关，侵袭和转移被认为是胃癌的恶性标志[2]。此外，胃癌细胞的耐药性也是胃癌患者治疗失败的最重要原因之一[3]。
microRNAs(miRNAs)作为高度保守的非编码RNA，靶向特定的mRNA，参与调节细胞增殖、死亡和信号通路等多种基本细胞过程。其中，miR-338可作为肿瘤发生发展过程中的抑制因子，诱导细胞凋亡与周期阻滞，抑制癌细胞增殖[4]。miR-338-5p作为凋亡相关酶中的内含子miRNA，可抑制肝细胞生长因子受体和皮生长因子受体来抑制食管鳞癌转移[5]、抑制胰腺癌细胞上皮间质转化[6]等。同时，miR-338可通过调控第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)和蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)组成的PTEN/AKT信号通路在肿瘤进展过程中发挥发挥肿瘤抑制作用[7]。抑制PTEN/AKT信号通路，可以抑制胃癌细胞侵袭转移及耐药作用[8]。然而，miR-338-5p参与胃癌细胞侵袭转移还未见报道，是否通过PTEN/AKT信号通路调控胃癌细胞的耐药性也尚待研究。探讨miR-338-5p能否通过PTEN/AKT信号通路影响胃癌细胞的侵袭和耐药，对加强对胃癌细胞转移、耐药的见解，提供靶点替代疗法具有重要意义。因此，本研究通过探讨miR-338-5p对胃癌细胞侵袭及耐药的调控作用，为后续寻找胃癌新的治疗方法提供理论基础。
1.1 材料
人胃癌细胞MKN-45来源于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)；
RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)(北京TBD生物技术发展中心)；
胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司)；
PBS，0.25%胰蛋白酶，结晶紫(南京森贝伽生物科技有限公司)；
减血清培养基，Opti-MEM(美国sigma公司)；
Lipofectamine®RNAiMAX(美国life公司)；
SYBR FAST qPCR Master Mix(美国KAPA Biosystems公司)；
基质凝胶，Tween-20，RIPA(强)组织细胞快速裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；
化学发光试剂(美国Millipore公司)；
细胞计数试剂-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)，PTEN蛋白一抗，AKT蛋白一抗，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)蛋白一抗，山羊抗兔二抗(武汉贝茵莱生物科技有限公司)；
Trizol，磷酸化蛋白激酶B(phosphoprotein kinases B，p-AKT)(英国abcam公司)。
1.2 方法
1.2.1 人胃癌MKN-45细胞复苏与培养 将冻存的人胃癌MKN-45细胞在37 ℃条件下融化后，吸至离心管中，加入含有105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待MKN-45细胞融合度达到90%后，进行传代(比例为1 ∶2～1 ∶3)培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。
1.2.2 miR-338-5p mimics及inhibitor的设计与合成 以miR-338-5p(GI：764016550)为对象(序列信息：AACAAUAUCCUGGUGCUGAGUG)，通过基因合成的方法获取目的基因序列，进行载体线性化、回收，与目的基因连接、转化、阳性克隆鉴定，测序，最终成功构建并合成miR-338-5p的mimics、inhibitor及相应NC。
1.2.3 分组干预 在完成1.2.1的细胞复苏和培养后，将MKN-45细胞分为control组、mimics组、mimics-NC组、inhibitor组和inhibitor-NC组，正常培养的MKN-45细胞作为control组，其余组分别转染miR-338-5p mimics质粒、miR-338-5p mimics NC质粒，miR-338-5p inhibitor质粒和miR-338-5p inhibitor NC质粒。转染样品稀释于250 μl Opti-MEM后静置和室温孵育备用，后续加入至含有MKN-45细胞的新鲜培养基的培养板孔中转染4 h后换新鲜培养基培养24 h。
1.2.4 CCK-8检测各组细胞增殖情况 收集干预后的细胞，于37℃、5% CO2的条件下培养至贴壁，分别在培养24，48，72 h后加入10 μl CCK-8溶液，并继续培养4 h。随后使用酶联免疫检测仪测量其在450 nm处的OD值，用OD值大小代表各组细胞增殖活力变化。
1.2.5 Transwell小室检测各组细胞迁移及侵袭检测 分组干预后的细胞换成无血清培养基培养24 h，接种到准备好的24孔板(与Transwell小室用PBS浸泡湿润过)被铺设matrigel胶后放置30 min。其后使用无血清培养液洗涤细胞并用1% FBS的培养基重悬细胞进行计数并稀释至1×105/ml，再接种到Transwell小室培养24 h。培养后使用4%甲醛溶液室温固定20 min并使用0.5%结晶紫溶液染色30 min，置于200倍显微镜下观察并对视野中的细胞进行计数。
1.2.6 qRT-PCR检测各组miR-338-5p及耐药蛋白基因表达 使用Trizol裂解各组干预后的细胞后提取其总RNA进行反转录并按照SYBR GREEN PCR Kit说明书进行qRT-PCR法检测。PCR扩增体系为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，循环40次。引物序列见表1。miRNA-338-5p以U6为内参，其余基因以GAPDH为内参，按照计算公式2-ΔΔCt=目标基因相对表达量进行数据处理分析。
表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information
1.2.7 Western blot检测PTEN/AKT信号通路蛋白的表达 每组细胞收集约1×106个，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液于4 ℃充分裂解，于95 ℃进行加热离心后取上清于100 ℃水浴中煮样5 min，冷却后加入10%的SDS-PAGE分离目标蛋白并转移至PVDF膜。接下来使用5%脱脂牛奶进行封闭，加入稀释比例为1 ∶1 000的PTEN一抗、AKT一抗、p-AKT一抗孵育1 h后，加入稀释比例为1 ∶10 000的羊抗兔二抗孵育1 h，于暗室使用发光液混匀并使用自动化学发光分析仪检测。TANON GIS软件读取相关条带灰度值。
2.1 转染miR-338-5p mimics/inhibitor对人胃癌MKN-45细胞中miR-338-5p表达水平的影响
与control组相比，mimics-NC组和inhibitor-NC组miR-338-5p表达量无显著差异。与control组和mimics-NC组相比，mimics组的miR-338-5p表达量显著提高(P<0.05)，与control组和inhibitor-NC组相比，inhibitor组的miR-338-5p表达量显著下调(P<0.05，见图1)，说明转染后的各组人胃癌MKN-45细胞都符合后续的实验要求。
与control组相比，△P<0.05；
与mimics-NC组相比，*P<0.05；
与inhibitor-NC组相比，#P<0.05图1 不同转染后miR-338-5p在胃癌细胞中的表达Figure 1 Expression of miR-338-5p in gastric cancer cells after different transfection
2.2 miR-338-5p抑制细胞增殖、迁移与侵袭
与control组和mimics-NC组相比，细胞培养24，48，72 h，mimics组细胞增殖活力显著下降(P<0.05)；
与control组和inhibitor-NC组相比，inhibitor组细胞增殖活力明显上升(P<0.05，见表2)，表明其细胞增殖没有受到抑制。与control组和mimics-NC组相比，mimics组细胞迁移和侵袭能力明显被抑制(P<0.05)；
与control组和inhibitor-NC组相比，inhibitor组细胞迁移和侵袭能力明显被增强(P<0.05，见图2)。
表2 miR-338-5p对MKN-45细胞增殖活力的影响Table 2 Effects of miR-338-5p on the proliferative activity of MKN-45 cells
与control组相比，△P<0.05；
与mimics-NC组相比，*P<0.05；
与inhibitor-NC组相比，#P<0.05图2 miR-338-5p表达对迁移和细胞侵袭能力的影响Figure 2 Effect of miR-338-5p expression on cell migration and invasion
2.3 miR-338-5p对耐药基因PGP、ABCB2和ABCG2 mRNA表达的影响
耐药基因mRNA表达的检测数据显示，与control组和mimics-NC组相比，mimcs组PGP、ABCB2和ABCG2的mRNA表达水平都显著下降(P<0.05)；
与control组和inhibitor-NC组相比，inhibitor组PGP、ABCB2和ABCG2的mRNA表达都显著上升(P<0.05，见图3)。
与control组相比，△P<0.05；
与mimics-NC组相比，*P<0.05；
与inhibitor-NC组相比，#P<0.05图3 miR-338-5p表达对细胞PGP、ABCB2和ABCG2 mRNA表达的影响Figure 3 Effect of miR-338-5p expression on the mRNA expression of PGP， ABCB2 and ABCG2 in cells
2.4 miR-338-5p对PTEN/AKT信号通路蛋白表达的影响
与control组和mimics-NC组相比，mimics组PTEN蛋白表达量显著上调(P<0.05)，p-AKT蛋白表达量显著下调(P<0.05)，AKT蛋白表达量无显著性变化(P>0.05)；
与control组和inhibitor-NC组相比，inhibitor组PTEN蛋白则显著上调(P<0.05)，p-AKT蛋白则显著下调(P<0.05)，AKT蛋白表达量无显著性差异(P>0.05，见图4)。
与control组相比，△P<0.05；
与mimics-NC组相比，*P<0.05；
与inhibitor-NC组相比，#P<0.05图4 miR-338-5p表达对细胞中PTEN，p-AKT和AKT蛋白表达的影响Figure 4 Effect of miR-338-5p expression on the protein expression of PTEN， p-AKT and AKT in cells
胃癌对中国人的健康造成巨大的负担，化学疗法是治疗胃癌的主要方法之一，但其耐药性限制了化学疗法的有效性，导致治疗失败，而遗传和表观遗传改变是胃癌发生和化疗耐药的关键因素[9]。最近研究发现，miRNAs的表达异常与肿瘤发病机制密切相关[10]，但仍缺乏对涉及miRNA的胃癌分子机制的深入研究。临床研究中，胃癌患者癌组织和血清中的miR-338-5p低表达，且与临床病理特征、肿瘤体积增长、淋巴结转移等呈正相关[4]。同时，miR-338-5p可以靶向B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物，介导抗肿瘤和基因调节作用，抑制胃癌细胞的生长[11]。本研究中miR-338-5p模拟物表达时，胃癌细胞的增殖被抑制；
而miR-338-5p表达缺失时，胃癌细胞增殖能力增强，表明miR-338-5p上调能够有效抑制胃癌细胞的增殖。因此，miR-338-5p在肿瘤细胞中差异表达时，能通过胞内信号调节肿瘤细胞的恶性行为[12]。
癌细胞的侵袭和转移程度能反应癌症的严重程度[13]。癌细胞侵袭发生时，癌细胞会离开原发病灶组织，占领邻近的组织并对其破坏，在该组织中继续繁殖生长[14]。并且癌细胞转移发生时，癌细胞会从原发病灶扩散到继发部位形成继发瘤[15]。许广松等[16]研究发现，桦木酸通过迁移和侵袭发挥对胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用，进而抑制胃癌生长和扩散。本研究中，miR-338-5p表达上调后，胃癌细胞的迁移和侵袭能力被抑制，miR-338-5p的表达下调时，胃癌细胞迁移和侵袭能力增强，因此miR-338-5p对胃癌细胞迁移和侵袭能力有显著的抑制作用。
PGP、ABCB2和ABCG2是癌细胞的耐药性相关的基因，在体内的表达下降时，癌细胞的耐药性也会相对减弱[17，18]。在miR-338-5p表达上调时，PGP、ABCB2和ABCG2 mRNA表达显著下调，而miR-338-5p表达受到抑制时则显著上升，表明miR-338-5p的表达上调能够抑制胃癌细胞的耐药性，增强药物治疗的效果。
PTEN/AKT通路与肿瘤发生和发展密不可分。PTEN能够调节相关因子表达抑制肿瘤血管的生成，从而削弱肿瘤细胞的侵袭[19]，其C2结构域能单独抑制瘤细胞迁移[20]。同时，p-AKT能够抑制肿瘤细胞的凋亡，通过催化相关蛋白质磷酸化促进其生长增殖，抑制凋亡[21]。PTEN作为PI3K/AKT通路中的主要抑制剂，当PTEN缺失从而激活PI3K/AKT后，会促使癌症恶化和增强其耐药性[22，23]。在异种移植肿瘤小鼠模型中，橙皮素可以调控AKT信号通路并上调PTEN表达，增强对胃癌的抗肿瘤作用，促进顺铂诱导的胃癌体内外凋亡[24]。本研究中miR-338-5p表达上调时，PTEN蛋白表达量显著上调，p-AKT蛋白表达量下调；
而miR-338-5p表达缺失使PTEN蛋白下调，p-AKT蛋白上调。该结果表明，miR-338-5p的表达能够促进PTEN蛋白表达，抑制AKT蛋白激活，从而调控PTEN/AKT通路影响胃癌的发展。
综上所述，miR-338-5p能通过影响PTEN/AKT通路，抑制耐药基因表达和胃癌细胞的侵袭迁移，从而抑制胃癌细胞的增殖，提示miR-338-5p有成为治疗胃癌的生物靶标的潜力，能够通过上调其基因表达来降低耐药性，让药物治疗达到更好的效果，这为胃癌的治疗提供了广阔的应用前景。然而该研究仅能提供基础数据支持，其在体内肿瘤中的作用还需进一步研究。
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